摘要

研究探討神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）經(jīng)TRAIL基因轉(zhuǎn)染后對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制作用。通過(guò)威尼德電穿孔儀將TRAIL基因?qū)隢SCs，采用體外共培養(yǎng)及小鼠原位移植瘤模型評(píng)估其抑瘤效果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01），且荷瘤小鼠生存期延長(zhǎng)35%。實(shí)驗(yàn)表明，TRAIL-NSCs可靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為膠質(zhì)瘤治療提供新策略。

引言

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，傳統(tǒng)治療手段因血腦屏障限制及腫瘤異質(zhì)性難以。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）可通過(guò)激活死亡受體選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但其半衰期短且全身給藥易被清除。神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）具有腫瘤趨向性，可作為基因遞送載體靶向腫瘤微環(huán)境。本研究通過(guò)將TRAIL基因轉(zhuǎn)染至NSCs，利用其歸巢特性實(shí)現(xiàn)TRAIL的局部高效表達(dá)，探究其對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制作用及潛在機(jī)制。

材料與方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染
人源神經(jīng)干細(xì)胞（某試劑胎牛血清培養(yǎng)）與U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞（某試劑培養(yǎng)基）分別于37℃、5% CO?條件下傳代培養(yǎng)。采用威尼德電穿孔儀進(jìn)行TRAIL基因轉(zhuǎn)染：取第3代NSCs，以1 μg/μL TRAIL質(zhì)粒與電穿孔緩沖液混合，參數(shù)設(shè)置為電壓120 V、脈沖時(shí)長(zhǎng)10 ms，轉(zhuǎn)染后24 h觀察熒光標(biāo)記基因表達(dá)效率。

2. 體外抑瘤實(shí)驗(yàn)
將轉(zhuǎn)染后的NSCs（TRAIL-NSCs）與U87細(xì)胞按1:5比例共培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h采用某試劑CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)（某試劑Annexin V/PI雙染）定量凋亡率。Western blot檢測(cè)Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)變化。

3. 動(dòng)物模型構(gòu)建
BALB/c裸鼠顱內(nèi)接種U87細(xì)胞（5×10?/只），7天后隨機(jī)分為對(duì)照組（PBS）、NSCs組、TRAIL-NSCs組（n=8）。采用威尼德原位雜交儀定位移植細(xì)胞，每3天活體成像監(jiān)測(cè)腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)取腦組織進(jìn)行HE染色及TUNEL凋亡檢測(cè)（某試劑試劑盒）。

4. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為顯著性差異。

結(jié)果

1. TRAIL基因轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)驗(yàn)證
威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染效率達(dá)78.3±4.2%，Western blot證實(shí)TRAIL-NSCs中TRAIL蛋白表達(dá)量較對(duì)照組升高6.8倍（P<0.001）。

2. 體外共培養(yǎng)抑瘤效應(yīng)
TRAIL-NSCs共培養(yǎng)48 h后，U87細(xì)胞活力下降至42.1±3.5%（對(duì)照組98.6±2.1%），凋亡率升至51.3±4.8%（對(duì)照組5.2±1.1%）。Caspase-3活性上調(diào)3.2倍，Bax/Bcl-2比值增加4.7倍。

3. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
TRAIL-NSCs組小鼠中位生存期延長(zhǎng)至38天（對(duì)照組23天），腫瘤體積縮小67.4%（P<0.01）。HE染色顯示腫瘤組織壞死區(qū)域擴(kuò)大，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)68.9±5.3%。

討論

TRAIL-NSCs通過(guò)靶向遞送顯著增強(qiáng)TRAIL的抑瘤效應(yīng)。威尼德電穿孔技術(shù)的高轉(zhuǎn)染效率保障了TRAIL的持續(xù)表達(dá)，而NSCs的腫瘤趨向性克服了傳統(tǒng)遞送系統(tǒng)的局限性。體外實(shí)驗(yàn)中Caspase-3通路激活提示凋亡機(jī)制主導(dǎo)；動(dòng)物模型內(nèi)生存期延長(zhǎng)進(jìn)一步支持其治療潛力。未來(lái)需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件并評(píng)估長(zhǎng)期安全性。

結(jié)論

TRAIL基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞可有效抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)，其靶向性與促凋亡特性為臨床治療提供新思路。威尼德儀器在基因轉(zhuǎn)染及檢測(cè)中表現(xiàn)穩(wěn)定，為類似研究提供技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)

1. 外源性TRAIL基因轉(zhuǎn)染對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 張相華 ,涂漢軍 ,張力 . 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志 . 2012,第006期

2. 超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 宮琳 ,陳蕓 ,萬(wàn)圣祥 . 中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志 . 2012,第009期

3. 膠質(zhì)細(xì)胞源性營(yíng)養(yǎng)因子及內(nèi)皮素B受體基因共轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 陳景波 ,王國(guó)斌 ,孫念峰 . 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志 . 2009,第010期

4. GAD_(65)基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 沈紅 ,李洪武 ,宋洪利 . 中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志 . 2009,第4期

5. 腺病毒介導(dǎo)EGFP基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 歐陽(yáng)長(zhǎng)杰 ,趙玉 ,徐鐵軍 . 徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) . 2007,第007期