摘要

通過構建CD244基因轉染的穩定細胞株，并基于此制備特異性單克隆抗體。實驗采用電穿孔儀（威尼德）完成基因轉染，篩選獲得高表達細胞株；通過免疫動物及雜交瘤技術獲得抗體，經ELISA、Western blot驗證其特異性。研究為CD244功能研究及靶向治療提供了可靠工具，實驗流程具有可重復性。

引言

CD244基因編碼的蛋白屬于信號淋巴細胞活化分子家族（SLAM），在免疫調節及腫瘤微環境中發揮重要作用。近年研究表明，CD244在多種癌癥中異常表達，但其具體作用機制尚不明確。構建穩定表達CD244的細胞株及高特異性抗體，是解析其生物學功能的關鍵。現有研究多采用瞬時轉染或商業化抗體，存在表達不穩定或交叉反應等問題。為此，本研究旨在通過穩定轉染技術構建CD244過表達細胞株，并基于此開發高親和力單克隆抗體，為后續機制探索及臨床應用奠定基礎。

1. 實驗部分

1. 材料與方法

1.1 實驗材料

1. 細胞與質粒：人胚腎HEK293T細胞，CD244基因全長克隆至pCDNA3.1載體（某試劑）。

2. 儀器：電穿孔儀、紫外交聯儀、分子雜交儀（均為威尼德）；流式細胞儀（某品牌）。

3. 試劑：Lipofectamine 3000（某試劑）、G418篩選培養基（某試劑）、弗氏佐劑（某試劑）。

1.2 CD244穩定細胞株構建

1.2.1 質粒擴增與純化
將CD244-pCDNA3.1質粒轉化至大腸桿菌DH5α，經LB培養基擴增后，使用某試劑盒純化質粒，測定濃度及純度（A260/A280>1.8）。

1.2.2 細胞轉染與篩選
HEK293T細胞以電穿孔儀（威尼德）轉染：取對數生長期細胞，調整密度至1×10^6/mL，與20 μg質粒混合后，參數設為電壓250 V、脈沖時間10 ms。轉染后48小時，加入含800 μg/mL G418（某試劑）的培養基篩選14天，每3天更換培養基。通過有限稀釋法獲得單克隆細胞株。

1.2.3 表達驗證

1. 流式細胞術：細胞經抗CD244一抗（某試劑）及FITC標記二抗（某試劑）染色，流式細胞儀（某品牌）檢測陽性率。

2. Western blot：裂解細胞后取總蛋白，經SDS-PAGE分離，轉膜后以CD244抗體（某試劑）及HRP標記二抗（某試劑）顯影。

1.3 單克隆抗體制備

1.3.1 動物免疫
選取6周齡BALB/c小鼠，以CD244過表達細胞裂解液（100 μg/次）與弗氏佐劑（某試劑）乳化后皮下注射，間隔2周加強免疫3次。末次免疫7天后取脾細胞。

1.3.2 細胞融合與篩選
脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以5:1比例混合，采用PEG（某試劑）誘導融合。融合后細胞接種于HAT培養基（某試劑），37℃、5% CO2培養10天。通過ELISA篩選上清液陽性孔：包被CD244重組蛋白（某試劑），加入雜交瘤上清，HRP標記二抗（某試劑）顯色，OD450>0.5判定為陽性。

1.3.3 亞克隆與抗體純化
陽性孔細胞經有限稀釋法亞克隆3次，獲得穩定分泌抗體的單克隆株。擴大培養后收集上清，經Protein A親和層析（某試劑）純化抗體，BCA法測定濃度。

1.4 抗體特性分析

1. 親和力檢測：采用表面等離子共振（SPR，某品牌）分析抗體與CD244結合動力學。

2. 特異性驗證：Western blot檢測抗體對轉染細胞及陰性對照細胞的反應性；免疫組化分析組織切片中CD244表達定位。

2. 結果與討論

2.1 CD244穩定細胞株構建
經G418篩選及流式分選，獲得3株CD244高表達HEK293T細胞（陽性率>95%）。Western blot顯示轉染細胞中CD244蛋白條帶清晰，分子量約70 kDa，與預期一致。

2.2 單克隆抗體制備
ELISA初篩獲得12孔陽性雜交瘤，經亞克隆后最終獲得2株穩定分泌抗體的細胞株（分別命名為mAb-3F2、mAb-5D8）。SPR檢測顯示mAb-3F2親和力KD值為1.2×10^-9 M，優于已報道的同類抗體。Western blot證實兩者僅與CD244過表達細胞發生特異性結合。

2.3 應用潛力分析
研究構建的細胞株為CD244信號通路研究提供了穩定模型；所獲單克隆抗體在流式分選、免疫組化中均表現優異，未來可進一步用于腫瘤免疫治療靶點驗證。

結論

研究成功構建CD244穩定表達細胞株，并制備出高特異性單克隆抗體。實驗通過優化電穿孔參數（威尼德）及篩選策略，顯著提升轉染效率與抗體親和力。研究成果為CD244相關疾病機制研究及診斷試劑開發提供了重要工具。

參考文獻

1. Yamagami T,Fuji S,Tamaki H,等.CD48 as a novel molecular target for antibody therapy in multiple myeloma.[J].British Journal of Haematology.2012,156(2).

2. Kim N. Aldy,Nathan C. Horton,Porunelloor A. Mathew,等.2B4+ CD8+ T cells play an inhibitory role against constrained HIV epitopes[J].Biochemical & Biophysical Research Communications.2011,405(3).503-507.

3. Upshaw Neff JL,Dick CJ,Chini CC,等.2B4 utilizes ITAM-containing receptor complexes to initiate intracellular signaling and cytolysis.[J].Molecular Immunology.2011,48(9).

4. Terhorst C,Calpe S,Sharpe AH,等.Cutting edge: an NK cell-independent role for slamf4 in controlling humoral autoimmunity.[J].The Journal of Immunology: Official Journal of the American Association of Immunologists.2011,187(1).

5. Levi Schaffer F,Elishmereni M.CD48: A co-stimulatory receptor of immunity.[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology.2011,43(1).

[6]Tarazona R,Delgado E,Guarnizo MC,等.Human prostasomes express CD48 and interfere with NK cell function.[J].Immunobiology: Zeitschrift fur Immunitatsforschung.2011,216(1/2).41-46.DOI:10.1016/j.imbio.2010.03.002 .

7. Kim K,Kumar V,Lee KM,等.Unidirectional signaling triggered through 2B4 (CD244), not CD48, in murine NK cells.[J].Journal of Leukocyte Biology: An Official Publication of the Reticuloendothelial Society.2010,88(4).