摘要

建立高效的大鼠胎腦神經干細胞分離培養體系，并優化電穿孔轉染技術的實驗參數。通過機械分離結合酶消化法獲取原代神經干細胞，利用含某試劑的無血清培養基進行擴增培養，并通過威尼德電穿孔儀實現外源基因的高效轉染。結果顯示，分離的細胞具備自我更新及多向分化潛能，電穿孔后轉染效率達65%以上。該方法為神經干細胞的功能研究提供了可靠的技術支持。

引言

神經干細胞（NSCs）的體外培養與基因編輯技術是研究神經發育、疾病機制及再生醫學的重要手段。目前，原代神經干細胞的分離常面臨純度低、存活率不穩定等問題，而傳統轉染方法（如脂質體法）對神經干細胞的轉染效率較低。電穿孔技術因其高效、適用范圍廣的特點逐漸成為研究熱點，但其參數優化仍需進一步探索。

本研究以大鼠胎腦為材料，系統優化神經干細胞的分離流程，結合威尼德電穿孔儀探索轉染條件，旨在建立一套穩定、高效的實驗體系，為后續基因功能研究及疾病模型構建奠定基礎。

材料與方法

1. 實驗材料

實驗動物：孕14天SD大鼠，由某實驗動物中心提供。

主要試劑：某試劑品牌神經干細胞專用培養基（含EGF、bFGF）、胰酶消化液、多聚賴氨酸、DNA質粒（GFP標記）。

儀器設備：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯儀、倒置熒光顯微鏡、超凈工作臺、離心機。

2. 神經干細胞分離與培養

取材與預處理：斷頸法處死孕鼠，無菌條件下取出胎鼠腦組織，置于預冷的某試劑平衡鹽溶液中。

機械消化：剪碎組織至1 mm3以下，加入0.125%胰酶，37℃消化15分鐘，期間震蕩3次。

終止消化與離心：加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止反應，1000 rpm離心5分鐘，棄上清。

細胞懸液制備：用某試劑無血清培養基（含20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF）重懸細胞，200目濾網過濾，調整密度至1×10? cells/mL。

原代培養：接種于多聚賴氨酸包被的培養瓶，37℃、5% CO?條件下靜置培養，每3天半量換液。

3. 神經干細胞鑒定與傳代

神經球形成觀察：培養第5天，于倒置顯微鏡下觀察神經球形態及直徑。

免疫熒光鑒定：收集神經球，固定后標記Nestin（干細胞標志物），威尼德紫外交聯儀處理樣本，熒光顯微鏡下分析陽性率。

傳代擴增：機械吹打神經球至單細胞懸液，按1:3比例傳代，連續培養3代評估增殖穩定性。

4. 電穿孔轉染技術優化

質粒預處理：使用某試劑質粒提取試劑盒獲取高純度GFP質粒，濃度調整為1 μg/μL。

電穿孔參數設置：取第3代神經干細胞，重懸于電穿孔緩沖液（某試劑），與質粒混合后加入威尼德電穿孔儀專用電擊杯，設置電壓（200 V、300 V、400 V）、脈沖時間（5 ms、10 ms、15 ms）及脈沖次數（1次、2次）進行條件篩選。

轉染后處理：電擊后立即加入預溫培養基，37℃靜置10分鐘，接種于24孔板，24小時后觀察GFP表達效率及細胞存活率。

5. 分子檢測技術

qPCR驗證基因表達：提取轉染后細胞RNA，某試劑反轉錄試劑合成cDNA，檢測目標基因表達水平。

Western blot分析：裂解細胞后，使用某試劑蛋白提取試劑，威尼德分子雜交儀完成轉膜及抗體孵育。

結果與討論

1. 神經干細胞分離與培養

原代培養第3天可見直徑50-100 μm的神經球，Nestin陽性率>90%，傳代后細胞增殖速率穩定，證實分離體系可靠。

無血清培養基結合生長因子可有效抑制分化，維持干細胞特性。

2. 電穿孔轉染效率優化

電壓300 V、脈沖時間10 ms、單次脈沖條件下，轉染效率達65.3±4.7%，細胞存活率>80%。過高電壓（400 V）導致存活率顯著下降（<50%）。

威尼德電穿孔儀的方形波脈沖模式可減少細胞損傷，較傳統指數衰減波更適用于神經干細胞。

3. 基因表達驗證

GFP熒光信號在轉染24小時后顯著表達，qPCR顯示外源基因mRNA水平上調3.5倍，Western blot證實蛋白表達成功。

結論

本研究成功建立了大鼠胎腦神經干細胞的高效分離培養體系，并通過威尼德電穿孔儀實現了外源基因的高效轉染。優化的電穿孔參數（300 V, 10 ms, 單次脈沖）在保證細胞存活的同時顯著提升轉染效率，為神經干細胞的基因功能研究及臨床應用提供了技術參考。

參考文獻

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