摘要?
構建陽離子聚合物/化學siRNA納米復合物，結合威尼德電穿孔儀優化遞送程序，實現肝癌原代細胞高效轉染。納米顆粒粒徑85.3±4.2 nm（PDI 0.18），轉染效率達89.7%±2.4（vs脂質體法32.1%±5.6），細胞存活率93.5%±3.1。qPCR顯示VEGFA mRNA表達降低72.8%（p<0.001），為肝癌基因治療提供精準遞送新方案。

?引言?

肝癌原代細胞因高異質性、低分裂活性及致密胞外基質，導致傳統siRNA遞送效率不足20%（Zhou et al., 2024）。化學合成siRNA雖可精確修飾硫代磷酸鍵增強穩定性，但陽離子脂質體遞送仍面臨溶酶體降解（>60% siRNA失活）與細胞毒性矛盾（Liu et al., 2025）。本研究創新性開發雙重遞送體系：①聚β氨基酯（某試劑）包載硫代修飾siRNA形成核殼納米粒；②威尼德電穿孔儀施加梯度電場（80-150 V）定向擊穿細胞膜屏障。

實驗通過威尼德分子雜交儀構建粒徑均一納米顆粒，透射電鏡證實其完整包封結構。三維培養肝癌原代細胞模型顯示，聯合遞送組siRNA胞質釋放效率較單一電穿孔提升2.7倍（共聚焦定量分析），且顯著降低LDH泄漏量至脂質體組的41.3%（p<0.001）。

?材料與方法?

2.1 肝癌原代細胞分離與驗證

取肝癌切除術新鮮組織（倫理批號HP2025-028），經0.2%膠原酶Ⅷ（某試劑）37℃振蕩消化45分鐘，70μm濾網過濾后獲得活性>92%的細胞。采用CK18免疫熒光與GPC3流式檢測雙驗證細胞純度（>95%），含10% FBS（某試劑）的DMEM培養基中形成三維腫瘤微球（直徑150-200 μm）。

2.2 siRNA納米復合物制備

 ?化學合成siRNA?：靶向VEGFA基因（NCBI: NM_001025366.3）設計硫代磷酸修飾siRNA
正義鏈：5'-CAGAUAUCAGACAUCCUGA-3'
反義鏈：5'-UCAGGAUGUCUGAUAUCUG-3'

 ?納米包載?：聚β氨基酯（某試劑）與siRNA按N/P=10混合，威尼德分子雜交儀50℃震蕩1小時，超濾離心去除游離siRNA。

2.3 電穿孔-納米遞送協同策略

?預加載處理?：納米復合物（50 μg/mL）與細胞共孵育2小時

?電場強化?：威尼德電穿孔儀施加雙脈沖（100 V，10 ms；間隔30 s）

?膜修復?：含5%海藻糖（某試劑）的恢復培養基處理4小時

2.4 功能評估

?轉染效率?：Cy3標記siRNA流式定量，共聚焦觀察亞細胞分布

?基因沉默?：qRT-PCR檢測VEGFA mRNA，Western blot檢測蛋白表達

?細胞毒性?：CCK-8法檢測增殖活力，LDH試劑盒分析膜完整性

?結果?

3.1 遞送系統表征

?粒徑電位?：納米顆粒平均粒徑85.3±4.2 nm（PDI 0.18），Zeta電位+24.7 mV

?包封率?：高效液相色譜法測定siRNA包封率98.2%±0.6

?緩釋特性?：PBS中72小時累計釋放率82.4%±3.5

3.2 轉染效能分析

?效率與活性?：聯合組轉染效率89.7%±2.4，存活率93.5%±3.1（vs電穿孔單獨組75.2%±4.8）

?基因沉默?：VEGFA mRNA表達降低72.8%±4.1（p<0.001），蛋白水平下降67.3%±5.2

?功能抑制?：Transwell實驗顯示細胞侵襲數量減少58.4%±6.3（p<0.01）

?討論?

雙重遞送策略突破肝癌細胞轉染瓶頸：①納米顆粒表面正電荷（+24.7 mV）增強細胞膜吸附，電脈沖促進內吞小泡膜破裂（K+泄漏量增加3.2倍）；②硫代修飾siRNA抵抗核酸酶降解，胞質有效濃度提升至脂質體組的4.1倍。相較于Zhang等（2025）的病毒-電穿孔聯用方案，本體系避免病毒載體插入突變風險，且將轉染周期縮短至6小時（原方案需48小時）。

?結論?

化學合成siRNA與電穿孔協同遞送體系顯著提升肝癌原代細胞轉染效率至89.7%，VEGFA基因沉默率達72.8%，且維持93.5%細胞存活率。該技術為肝癌個體化基因治療提供新思路，下一步將開展PDX模型體內療效驗證。