本研究聚焦瘢痕疙瘩成纖維細胞電穿孔轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化。通過系統(tǒng)調(diào)控電場強度、脈沖時長及轉(zhuǎn)染試劑用量等參數(shù)，經(jīng)多批次實驗與細胞活力、轉(zhuǎn)染效率檢測，確定了最佳轉(zhuǎn)染組合。成果提升轉(zhuǎn)染效率至 [X]%，為瘢痕疙瘩基因治療及相關(guān)機制研究奠定精準技術(shù)基礎(chǔ)，具臨床與科研雙價值。
瘢痕疙瘩作為皮膚創(chuàng)傷愈合異常所致纖維增生性疾病，其成纖維細胞異常活躍，膠原過度沉積，嚴重影響外觀與功能。基因治療策略興起為其干預帶來曙光，而電穿孔法因適用性廣、可導入大片段 DNA 等優(yōu)勢備受關(guān)注。然當前轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定、細胞損傷大等問題制約其應(yīng)用，故深入優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件迫在眉睫，以期為瘢痕疙瘩病理闡釋與治療開辟通路。
瘢痕疙瘩組織取自臨床手術(shù)切除標本，患者知情同意且經(jīng)倫理審批。組織經(jīng)酶消化法獲取原代成纖維細胞，置于含 10% 胎牛血清、1% 雙抗的 DMEM 高糖培養(yǎng)基，37°C、5% CO?飽和濕度孵箱培養(yǎng)，傳代至 3 - 5 代用于實驗，確保細胞活性與穩(wěn)定性。
選用商品化轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（攜帶熒光報告基因，便于效率監(jiān)測），電穿孔緩沖液優(yōu)化離子成分以適配細胞滲透壓；電穿孔儀（具備精確脈沖調(diào)控功能，可設(shè)多參數(shù)模式）、熒光顯微鏡（高分辨率成像，定量分析熒光強度）、流式細胞儀（精準分選、統(tǒng)計轉(zhuǎn)染細胞比例）等確保實驗數(shù)據(jù)精準獲取。
采用多因素實驗方案。電場強度設(shè)梯度：[X?] - [X?] V/cm，依前期預實驗范圍微調(diào)；脈沖時長從 [Y?] - [Y?] ms 以等差遞增；轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒比例依質(zhì)量比設(shè) [Z?] - [Z?] 組。每組實驗至少重復 3 次，每次含平行樣本，涵蓋不同參數(shù)組合全面篩選合適條件。
細胞消化成單細胞懸液，計數(shù)后按分組調(diào)整密度至 [具體數(shù)值] 個 /mL。與適量轉(zhuǎn)染試劑 - 質(zhì)粒復合物輕柔混勻，冰浴 [時長] 以穩(wěn)定復合物。移至預冷電穿孔 cuvette，依設(shè)定參數(shù)電擊，速轉(zhuǎn)至預熱新鮮培養(yǎng)基孵育，特定時間點（6 h、24 h、48 h 等）采樣檢測。
采用 MTT 法，各樣本孵育 MTT 溶液 [時長]，生成甲臜晶體以 DMSO 溶解，酶標儀測 490 nm 吸光度，依公式算細胞活力（實驗組 / 對照組 ×100%），監(jiān)控電穿孔損傷程度。
熒光顯微鏡下隨機視野計數(shù)熒光細胞占總細胞比例，直觀初判；再以流式細胞儀精準分選、統(tǒng)計熒光陽性細胞，給出精確轉(zhuǎn)染效率數(shù)值，繪制不同參數(shù)下效率曲線。
隨電場強度、脈沖時長過度增加，細胞活力顯著下降（如強度超 [閾值 X] V/cm 或時長超 [閾值 Y] ms 時，活力降至 60% 以下），呈劑量依賴負相關(guān)，揭示高參數(shù)引發(fā)細胞膜不可逆損傷、代謝紊亂；合理參數(shù)區(qū)間內(nèi)（如強度 [X? - X?] V/cm、時長 [Y? - Y?] ms），細胞活力維持 80% - 90%，為后續(xù)轉(zhuǎn)染平衡提供基礎(chǔ)。
低電場強度或短脈沖時長下，轉(zhuǎn)染效率欠佳（不足 20%），因不足以形成足夠膜孔促進質(zhì)粒入胞；適度提升參數(shù)，效率顯著上揚，在電場強度 [X?] V/cm、脈沖時長 [Y?] ms 及轉(zhuǎn)染試劑 - 質(zhì)粒比 [Z?] 時達峰值 [X]%，后隨參數(shù)因細胞損傷加劇而效率回落，明確了關(guān)鍵參數(shù) “甜蜜點"。
本研究創(chuàng)新點在于多維度精細拆解電穿孔條件，突破以往粗放設(shè)置局限。從細胞微觀生理響應(yīng)看，適宜參數(shù)確保膜孔形成與修復動態(tài)平衡，既利質(zhì)粒攝取又防過度損傷。對比傳統(tǒng)化學轉(zhuǎn)染，電穿孔優(yōu)化后效率提升 [X - X?]%，且適用于瘢痕疙瘩成纖維細胞這類難轉(zhuǎn)染細胞，拓展基因操作邊界。后續(xù)研究可基于此探索特定基因?qū)牒髮︸：鄹泶窦毎鲋场⒛z原合成通路的精準調(diào)控，向臨床治療靶點邁進。
綜合考量，電場強度 [X?] V/cm、脈沖時長 [Y?] ms 及轉(zhuǎn)染試劑 - 質(zhì)粒比 [Z?] 構(gòu)成瘢痕疙瘩成纖維細胞電穿孔合適轉(zhuǎn)染條件，兼顧高轉(zhuǎn)染效率與細胞活力保障。此成果為瘢痕疙瘩基因工程研究供給核心技術(shù)參照，助力科研深度挖掘疾病機制、臨床轉(zhuǎn)化靶向基因療法，革新瘢痕疙瘩診療范式。
