1 雜交溶液或洗滌溶液在使用前未預熱

2 探針濃度過高或探針未變性。將雜交液裝入雜交管時，體積減少，探針濃度發生了變化，應確保相應地調整探針濃度。

3 未從探針溶液中去除未結合核苷酸。

4 預雜交和雜交溶液中的預雜交或阻斷劑不足，充分的預雜交對于阻止膜的非特異性雜交非常重要。

5 雜交或洗脫條件不夠嚴格：

6 降低鹽濃度。

7 提高溫度。

8 增加SDS的濃度。

9 增加洗脫次數。

10 膜太干燥，這通常可能是明顯重疊問題的原因，可能由以下原因引起：

11 探針體積太小。溶液更換速度太慢，尤其是批量更換處理時分子雜交儀放置不平整。

可變軸角度過大。

12 膜上殘留的瓊脂糖可能導致背景模糊。在轉化膜后和固定交聯前（尤其是真空吸干后），應在2 x SSC中沖洗膜，以去除殘留的瓊脂糖和多余的鹽。

13 多個過濾器在瓶子中沒有用篩網隔開。

14 放射自顯影問題。放射自顯影圖上的隨機黑點和“閃電”標記可能是由靜電引起的。